本期遗传学与整合组学课题组为大家带来的是年1月发表在NatureCommunications的"Tumor-derivedexosomalmiR--3pinducescancer-associatedfibroblastactivationtofosterlungmetastasisoflivercancer"一文，描述了肿瘤来源的外泌体与肝癌肺转移之间的相互关系以及相关的机制研究。01PART01研究背景肺转移是肝细胞癌(HCC)中最常见的远处侵袭进展也是与癌症相关的死亡的主要原因之一。肝癌的肺转移与成纤维细胞有关有关，且涉及肿瘤微环境中各种细胞之间的细胞间通讯，肿瘤来源外泌体参与这个过程，具有许多重要作用。一些研究报告指出，外泌体介导肿瘤微环境的调节，以促进肿瘤的转移和进展；miRNAs可抑制靶mRNA的翻译，外泌体中高水平的miRNAs在多种肿瘤类型中起到免疫调节、化疗耐药和转移的作用。2PART02简介本篇文章报道了来源于高转移肝癌细胞的外泌体可以从肿瘤细胞转移到成纤维细胞中，外泌体中携带有miR--3p。B4GALT3是成纤维细胞中的一种介导糖基化的蛋白，作为miR-3p的直接下游靶点，miR--3p可抑制B4GALT3的表达，从而激活成纤维细胞中β1-整合素-NF-κB信号转导，促进成纤维细胞的活化，被激活的成纤维细胞会分泌IL-6、IL-8、IL-1β等在内的促炎细胞因子，从而进一步促进癌症进展。研究确立了肿瘤细胞和成纤维细胞之间的相互作用并进一步阐明了肝癌肺转移的分子机制，解释了为什么不同类型的肝癌表现出不同的诱导肺转移能力，并表明了外泌体miR--3p的高表达与肝癌的肺转移密切相关。这一研究结果可为预防和治疗癌症转移提供潜在的靶点，提升临床治疗的成功率。3PART03实验思路
1.验证肝癌细胞、外泌体、成纤维细胞之间的关系
2.证明外泌体miRNA与成纤维细胞间的联系
3.找到miR--3P在成纤维细胞中的直接作用靶点
4.确定miR--3p与靶向受体结合后使成纤维细胞活化的信号通路
5.验证活化的成纤维细胞与肝癌发展的关系
6.确定miR--3p与肝癌肺转移之间的关系
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PART04研究结果
在以往的研究中，CAFs已被证明积极参与肿瘤转移过程，了解肿瘤细胞对CAFs的激活作用是非常重要的。由于外泌体-分泌是肿瘤引起全身改变的重要途径，所以作者合理地提出了外泌体是否参与成纤维细胞激活的猜测。为了证明猜想，作者通过选择不同转移程度的肿瘤细胞，分离提取出了外泌体，分析其杯状结构、大小和数量(图1a，b)，发现证明了高转移癌细胞分泌的外泌体比低转移的要多得多(图1b)。此外，作者还检测了外泌体特征物HSP70、CD63、TSG、CD9和CD81的检测进一步证实了分离的颗粒是外切体(图1c)。为了研究外泌体的运输，作者用了不同颜色分别标记肿瘤来源的外泌体（绿色）和成纤维细胞（红色），共聚焦成像显示受体成纤维细胞中存在绿色斑点，这表明不同肿瘤细胞释放的标记外泌体被传递到成纤维细胞(图1d)。且作者为了进一步评价不同转移程度癌细胞来源的外泌体在体外培养成纤维细胞能力的差异，通过Transwell实验分析得出了与高转移癌细胞外泌体共培养的成纤维细胞迁移数高(图1e)，同时作者也进行了伤口愈合分析进一步证实了这个结果。通过RT-PCR发现高转移癌细胞的外泌体培养的成纤维细胞表达较高水平的促炎基因，这些基因在调节炎症微环境和促进肿瘤发展方面具有重要作用(图1f)，胶原分析中结果也出现了类似的结果(图1g)。作者还进行了体内实验，注射不同转移程度肝癌细胞来源的的外泌体，在高转移癌细胞诱导的肺转移中观察到CAFs的富集。
综上所述，以上结果提示了来源于高转移癌细胞的外泌体有助于成纤维细胞的激活，从而促进肝癌的肺转移。
Fig.1高转移肝癌细胞分泌的外切体调节成纤维细胞的激活，促进肺转移
为了探索肿瘤来源的外泌体是如何激活成纤维细胞的，作者基于外泌体的特性及miRNA的重要功能，作者了假设肿瘤来源的外体miRNAs介导会促进成纤维细胞的激活。为了确定涉及的特定miRNAs，作者通过了微阵列来生成来自此前分组的不同转移程度肝癌细胞的外泌体的miRNAs图谱。如前所述，将结果分为两组，将结果进行比较（图2a）。对两个高转移癌细胞来源的外泌体中上调最多的21个miRNAs(倍数变化10)进行了验证(图2b)。通过分析炎症因子基因的表达确立了miR--3p(图2c)，同时作者也发现，miR--3p模拟物也有助于成纤维细胞的运动潜能(图2d)。为了进一步研究miR--3p的作用，作者将miR--3p抑制剂稳定转染到高转移肝癌细胞中，正如预期的那样，miR--3p对成纤维细胞的作用被其特异性抑制剂取消(图2e，f)。
这些发现揭示了肿瘤来源的外泌体miR--3p介导成纤维细胞的激活。
Fig.2外泌体miR--3p由高转移肝癌细胞分泌，介导成纤维细胞活化
作者为了确定外泌体miR--3p在成纤维细胞中的靶点，利用两种生物信息学工具(miRDB和microTCDS)预测了一组共同的靶基因，寻找一个可能作用靶点，通过后续实验验证。作者通过数据库认为B4GALT3是miR-3p的直接靶点，负责成纤维细胞的激活(图3a)，然后进行实验，首先将miRNA转染入成纤维细胞中，通过WB和PCR检测目的靶向的表达水平，结果发现，靶向蛋白表达下调（图3b）。然后将miRNA序列与靶向蛋白B4GALT3全长序列进行比对，表明是潜在靶点(图3c)。构建B4GALT3序列的野生型和突变型，加入到荧光素酶载体中，与miRNA同时转染进入成纤维细胞中，检测荧光素酶活性。在miR--3p存在下，与野生型结合位点载体共转染的MRC5的荧光素酶活性明显降低。然而，含有突变结合位点载体的细胞没有显示出这种抑制(图3d)，这些结果进一步表明B4GALT3是成纤维细胞miR--3p的直接靶点。此外，为了确定B4GALT3在成纤维细胞激活中的功能，作者用siRNAs下调了成纤维细胞中B4GALT3的表达，进行Transwell实验和RT-PCR进行炎症基因表达分析。结果表明，靶向B4GALT3的siRNA处理的成纤维细胞显示出促进运动和炎症基因表达的作用（图3e，f）。此外，全长B4GALT3的过表达可以中和miR--3p对成纤维细胞激活的影响(图3g，h)。
这些数据表明B4GALT3是miR-3p的直接下游靶点，并介导成纤维细胞的激活。
Fig.3B4GALT3是miR--3p在成纤维细胞活化中的直接下游靶点
以上结果表明，miR--3p可增强MRC5细胞中促炎基因的表达，如IL-1β、IL-6和IL-8，它们是NF-κB的已知靶点。与低转移肿瘤细胞相比，高转移肿瘤细胞的条件培养液(CM)促进了MRC5中磷酸化的NF-κB表达、IκBα抑制和NF-κB信号激活（图4a，c）。作为对比，作者用了同样来源的外泌体处理MRC5，也得到了类似的结果(图4b，d)。此外，miR--3p的表达或B4GALT3的抑制也促进了NF-κB的磷酸化和IκBα的抑制(图4e)，而B4GALT3的表达抑制了NF-κB的磷酸化(图4e)。这些数据表明miR--3p通过介导NF-κB信号激活而激活成纤维细胞。作者分析了B4GALT3、整合素、NF-κB信号之间的相互关系，认为β1-整合素在miR3p诱导的NF-κB信号活化中的作用值得进一步研究。通过免疫印迹分析，miR--3p模拟或B4GALT3下调可促进β1-整合素的表达，而B4GALT3的表达则抑制B4GALT3的表达(图4e)。此外，研究表明，当蛋白质合成被环己酰亚胺(CHX)阻断时，B4GALT3促进了β1-整合素的降解(图4g)。
综上所述，这些结果提示外体miR--3p抑制B4GALT3的表达，从而促进成纤维细胞活化中的β1-整合素-NF-κB信号转导
Fig.4外泌体miR--3p通过B4GALT3-β1-整合素-NF-κB信号激活成纤维细胞
一些研究表明CAFs通过分泌多种促炎细胞因子和趋化因子，可在肿瘤进展中发挥重要作用。为了确定miR-3p培养的成纤维细胞是否有助于促进肿瘤特性，作者进行了一系列体外和体内实验。首先，观察到miR-3p的过表达促进了成纤维细胞分泌白细胞介素(IL)-6和IL-8(图5a)。然后，用miR-3p预处理的成纤维细胞中的CM培养肿瘤细胞。如图5b、c、e、f、h-j所示，培养后肿瘤细胞的干性基因表达增强，球体形成能力增强，运动能力增强，上皮-间充质转化(EMT)过程增强，对索拉非尼的抗性增强。重要的是，用中和抗体阻断IL-6或IL-8，部分逆转了肝癌细胞与经miR-3p预处理的成纤维细胞收集的CM孵育后增加的球体形成能力、运动性和对索拉非尼的耐药性(图5d，g，I)。此外，在体内，经miR--3p预处理的成纤维细胞CM促进了肿瘤细胞的致瘤性和增殖(图5k)。这些结果表明，miR-3p培养的成纤维细胞可促进肝癌的肿瘤干性、EMT、化疗耐药性和致瘤性。为了进一步研究CAFs在肝癌中的作用，作者从有门静脉癌栓的浸润性肝癌患者中分离出原代CAFs，并从正常肝组织中分离出成纤维细胞。发现原发CAFs分泌的IL-6和IL-8水平高于成纤维细胞(图l)。此外，作者发现更重要的是，正常成纤维细胞相比，B4GALT3在原发性CAFs中的表达水平降低(图5m)。
综上所述，在原发性肝癌的肝内转移生态位中，可能存在类似的miR--3p转移途径引起的肿瘤细胞与成纤维细胞之间的相互作用机制。
Fig.5miR--3p激活的成纤维细胞促进肝癌进展
作者通过电子显微镜和Nanosight颗粒跟踪分析观察了从HCC患者和健康对照收集的血清外切体(图6a，b)。与之前的研究结果相类似的是，与健康对照组相比，肝癌患者的血清外泌体数量显著增加。然后作者研究了外泌体miR--3p在不同血清样本(25例健康对照、90例无肺转移的肝癌患者和20例有肺转移的肝癌患者)中的表达情况，所示，与健康对照组相比，HCC患者血清外泌体miR--3p表达升高（图6c）。更重要的是，有肺转移的HCC患者血清中miR--3p的表达水平明显高于无肺转移的患者。为了进一步确定miR--3p与临床病理特征的相关性，作者对85例原代人肝癌组织进行了原位杂交，证实miR--3p在肝癌中存在差异表达，与血清外泌体的结果相似(图6d)。根据miR--3p表达水平将肝癌组织分为低表达组和高表达组，miR--3p的高表达很好地预测了较差的总体存活率和较差的无病存活率（图6e）。综上所述，这些数据表明miR--3p在肝癌组织中存在差异表达，并且miR--3p在肝癌组织中的高表达预示着不良预后。此外，血清外泌体miR--3p的高表达与肝癌的肺转移有关。为进一步证实miR--3p在肝癌组织和肺转移组织中的表达定位，作者对人肝癌组织和肺转移组织连续切片进行miR--3pa原位杂交，并结合免疫组织化学方法检测肝癌标志物(AFP)和成纤维细胞标志物(α-SMA)。结果显示miR--3p信号存在于肿瘤细胞和肿瘤周围的一些成纤维细胞中（图6f）。
综上所述，肿瘤外泌体miR--3p通过下调B4GALT3，将成纤维细胞转化为CAFs，激活β1-整合素-NF-κB信号通路，促进肝癌的肺转移。激活的成纤维细胞通过分泌IL-6和IL-8进一步促进肝癌细胞的干性、EMT、化疗耐药性和致瘤性(图6g)。我们的研究结果还表明，肿瘤来源的外泌体miR-3p在促进炎症微环境和促进肺转移的细胞间通讯中具有重要作用。
Fig.6miR--3p与肝癌肺转移的关系
5PART05总结与展望在研究中，首先分析了高转移癌细胞和低转移癌细胞外体miRNA的不同图谱。在此基础上，发现miR--3p可以通过外泌体直接从肿瘤细胞转移到肺转移前壁龛的成纤维细胞中，并通过降低其靶基因B4GALT3的表达来激活β1整合素-NF-κB信号通路，从而将成纤维细胞转化为CAFz。此外，CAFs通过分泌IL-6和IL-8促进肿瘤的发展。肿瘤细胞和成纤维细胞之间的相互作用进一步阐明了肝癌肺转移的分子机制，并解释了为什么不同类型的肝癌表现出不同的诱导肺转移能力。血清外泌体miR--3p的高表达与肝癌的肺转移密切相关，这对肝癌的有效防治具有重要意义。
根据数据分析，miR--3p在HCC中的高表达预示着不良的预后，作者认为未来还需要研究miR--3p在肝癌中的作用。
此外，就miR--3p在血清外泌体中的高表达与肝癌患者的肺转移呈正相关的现象，未来对于肝癌以及肝癌肺转移治疗可以有新的思路。
文献分享者：刘云原文引用：doi:10./s---0预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
